MS1 イオンを HMDB 代謝物データベース（ver. 5.0、2025 年 4 月 17 日アクセス）、MassBank of North America（2025年8月25日アクセス）、 MetFrag（2025年 9 月 3 日アクセス）、LIPID MAPS 脂質データ ベース（2025 年 8 月 25 日アクセス）に対して検索した。MS2 スペクトルが 1 つの血液代謝物と一致した場合、当該化合物をランク A として注釈した。有意な MS2 スペクトルが得られなかったが、MS1 値が HMDB に登録された唯一の代謝物と一致した場合も、ランク A として注釈した。MS1 および / またはMS2 スペクトルが一致したが、複数の候補代謝物ヒットにより単一化合物に特定できなかった場合、血清代謝物である可能性が最も高いと判断した化合物をランク B として注釈した。代謝物の選択とモデル構築 代謝物の選択と精緻化は 2 段階で行った。胆汁および血清のメタボローム解析において、LC-QTOF-MS により多数のピークを検出した。多変量解析に先立ち、拒絶群と非拒絶群間で変動が大きいピークまたは差異が最小限のピークを手動で除外した。続いて、MetaboAnalyst（ver. 6.0、2025 年 8 月 23 日アクセス）における部分最小二乗判別分析（PLS-DA）を用いて、両群を区別する重要な代謝特徴を選択した。次に、選択された代謝特徴量から冗長な特徴量と空白値を手動で除去した。この段階では化合物の厳密な同定は行わず、代謝特徴量をピーク ID として扱った。このステップで胆汁と血清から多くの代謝物が選択された。 第 2 の選択は以下の手順で実施された：拒絶群と非拒絶群を区別する二値予測モデルの開発過程において、LASSO 回帰を用いて胆汁代謝物をさらに選択した。連続変数である RAI の予測モデル開発過程では、LASSO およびランダムフォレスト（RF）回帰分析を用いて血清代謝物をさらに選択 した。最終的に、各予測モデル構築には胆汁および272温度は 4℃であった。 1 µL および 2 µL のサンプルをそれぞれ陽イオン モード（pos）と陰イオンモード（neg）で注入した。質量分析（MS）データは、各イオンモードにおいて70 ～ 900 m/z の範囲でエレクトロスプレーイオン化法を用いて個別に取得した。MS パラメータはデフォルト設定を以下のように使用した：インターフェース電圧 4.5 kV（pos）および− 3.5 kV（neg）、インターフェース温度 300 ℃、噴霧ガス流量 3 L/min、加熱ガス流量 10 L/min、乾燥ガス流量 3 L/min、ヒ ー ト ブ ロ ッ ク 温 度 400 ℃、DL 温 度 250 ℃。サンプル測定前に、校正剤（ESI Tuning Mix for Ion Trap、Supelco、Bellefonte、PA、USA）を 用いて m/z 値を校正し、サンプル測定全体を通じて質量精度が 10 ppm 以内に収まるようにした。試験した代表的なサンプルの混合物を品質管理（QC）基準として使用した。QC サンプルは、バッチの開始時、中間、終了時に合計 6 回注入され、測定中の検出化合物の安定性を確認した。 各ピークの相対存在量は、フルスキャンモードにおける親イオン（MS1）の強度によって評価された。構造推定に必要な断片イオン（MS2）を得るため、データ依存型自動 MS/MS モードによる追加測定も実施した。断片化は、衝突ガスとしてアルゴンを用い、衝突エネルギー 30 eV （スプレッド 15 eV）で実施した。MS2 スペクトルは、m/z 50 ～ 900 の範囲で強度閾値 2000（陽イオン）および 500（陰イオン）を超える上位5 イオンについて同時に測定された。データ収集には、LCMS9030（島津製作所）用 LabSolutionsソフトウェアバージョン 5.118 を使用した。 取得したデータを xml ファイルに変換後、MS-DIAL（ver. 5.1）を用いてピーク検出とアラインメントを行い、ピーク ID を割り当てた。その後、MS-DIAL と MS-FINDER（ver. 3.56）の両方を使用して化合物名を注釈付けした 7,8)。必要に応じて、
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