対象と方法サンプル調製 胆汁代謝物は以下の手順で抽出した。50 µL の胆 汁 を 200 µL の メ タ ノ ー ル と 室 温 で 混 合 し、激しく振盪した後、氷上で 30 分間静置した。再度振盪した後、混合液を遠心分離（14,000 g、10 分間、 4℃）し上清を回収した。上清 10 µL に内部標準溶液 490 µL を混合し、同様に遠心分離して上清 200 µL を得た。内部標準溶液は、5 mM L- フェニル アラニン -13C6、0.25 mM スルファジメトキシン、 0.5 mM フシジン酸、0.5 mM PE(34:1)d31 を UPW/MeOH/IPA (4:4:2, v/v/v) に溶解したものである。 血清代謝物は以下の手順で抽出した。血清 20 µL に室温でメタノール 80 µL を添加し、激しく振盪した後、氷上で 30 分間静置した。再度振盪後、14,000 g、10 分間、4℃で遠心分離し上清を回収した。この上清 40 µL に内部標準溶液 160 µL を加え、同様に遠心分離して 180 µL の上清を得た。これを液体クロマトグラフィー四重極飛行時間型質量分析計（LC-QTOF-MS）で分析した。LC-QTOF-MS 分析 1 ～ 2 µL のサンプル溶液を LC-QTOF-MS システ ム（ 島 津 LCMS9030； 島 津 製 作 所、 京 都 ）に注入した。代謝物分離には Accura Triart C18カ ラ ム（2.1 × 100 mm、1.9 µm；YMC、 京 都 ）を用いた。移動相 A は超純水中の 0.1% (v/v) ギ酸、 移動相 B はメタノール / アセトニトリル（1:1, v/v）中の 0.1% (v/v) ギ酸で構成した。代謝物は、0.32 mL/min の流速で以下のグラジエントプログラムによりカラムから溶出させた。B 0% から開始し、初期条件を 1 分間維持、1 ～ 3 分間で B 5% まで増加、3 ～ 9 分間で B 90% まで増加、9 ～ 11 分間で B 100% まで増加、11 ～ 15 分間で B 100% を維持、 15 ～ 15.5 分 間 で B 0% に 戻 し、 15.5 ～ 20 分 間 は 0% B を維持した。1 検体の測定所要時間は 20 分であった。カラム温度は 45℃、サンプルクーラーノンターゲットメタボローム解析による急性拒絶反応の予測と診断（承認コード：20-008、承認日：2020 年 11 月 27 日）。（#190-11101）より購入した。フシジン酸は東京 18:1 ホスファチジルエタノールアミン（PE(34:1)d31）は Avanti Research（アラバスター、アラバマ州、（RAI）を用いて拒絶反応の重症度を評価した。解析を実施し、AR の予測・診断に有用な代謝物マーカーの検出を試みた。倫理審査 本研究はヘルシンキ宣言に準拠して実施され、自治医科大学倫理審査委員会により承認された全患者または法定代理人からインフォームドコンセントを取得した。化学薬品および試薬 メタノール（MeOH）、アセトニトリル、2- プロ パノール、超純水（UPW）、およびギ酸は、富士 フイルム和光純薬（大阪）より購入し、LC-MSグレードであった。L- フェニルアラニン -13C6 はMedChemExpress（米国ニュージャージー州モンマスジャンクション、#HY-125731S）より入手した。スルファジメトキシンは富士フイルム和光純薬 化学工業（東京、#F1007）から入手し、16:0-d31-米国、#860374P）から調達した。検体採取と拒絶反応評価方法 生体肝移植では、胆汁外瘻チューブを留置し、このチューブを通じて胆汁を採取する。肝移植後、胆汁および血清検体を採取し、分析まで−80℃で保存した。本研究では、術後 1 日目（POD1）に採取した胆汁を POD1 胆汁、術後 14 日目（POD14）に採取した血清を POD14 血清と呼称する。本研究では、標準的手法に従い、rejection activity index271
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