対象と方法実施した。反応液には、1-10 ng の DNA テンプ レート、10 µL の Q5® High-Fidelity DNA Master Mix（New England Biolabs、Ipswich、 MA、 USA）、および それぞれ 0.05 µM のフォワードおよびリバースプ ラ イ マ ー を 含 め た。3 ス テ ッ プ PCR 反 応 におけるアニーリング温度は、製造元のウェブサイト にある Tm 計算ツール（http://tmcalculator.neb.com/#!/main）に基づいて設定した。PCR 条件は、98 ℃で 30 秒間の初期変性後、35 サイクルの 98 ℃で 10 秒間の変性、68 ℃で 30 秒間のアニーリング、72 ℃で 30 秒間の延長を行い、最後に 72 ℃で 2 分間の最終延長を実施した。PCR 産物は、ExoSAP-IT Express（Thermo Fisher Scientific、Waltham、 MA、 USA）を用いて、製造元のプロトコルに従い精製した。精製後の PCR 産物は、フォワードプライマーと共にユーロフィンジェノミクス株式会社（東京都）に提出し、シークエンス解析を行った。TaqMan ジェノタイピング TaqMan ジ ェ ノ タ イ ピ ン グ ア ッ セ イ は、MicroAmp Fast Optical 96 ウ ェ ル 反 応 プ レ ー ト（Thermo Fisher）を使用し、実施した。各 10 µL の反 応 混 合 物 に は、2X TaqMan Genotyping Master Mix（Thermo Fisher）5 µL、40-80X Primer Probe Mix（Thermo Fisher）0.125-0.25 µL、および 1-10 ngの DNA を含めた。使用した Primer Probe Mix を表 1 に示す。増幅およびアレル識別は、7500 Fast Real-Time PCR System（Thermo Fisher）を用いて行った。PCR 増幅条件は、60 ℃で 30 秒間のプレPCR リード後、95 ℃で 10 分間の初期変性、その後、95 ℃で 15 秒間の変性、58 または 60 ℃で 1 分間のアニーリングおよび延長を 45 サイクル行い、60℃ で 30 秒間のポスト PCR リードを行った。プレおよびポスト PCR プレートリードデータを、7500 Software v2.0.6（Thermo Fisher）を用いてアレル識別を行った。アレルコール品質が 95％未満の254超えて予後に関与している SNP は明らかとなって いない。そこで、本邦でも予後予測に用いることの できる SNP を明らかにするため、JPLSG AML-05研究コホートを用いて、これまでに海外の小児AML 治療において予後や薬剤代謝物濃度と相関が報告されている薬剤代謝動態関連遺伝子の SNP を解析した。患者 JPLSG AML-05 研究に登録され、研究使用の同意が得られている診断用血液サンプルから抽出 された 239 名の患者のうち、中間リスク、高リスク 群 に 含 ま れ た 患 者 146 名 の DNA を 使 用 し た。DNA は DNeasy Blood & Tissue Kit（Qiagen）を用いて抽出した。SNP のジェノタイピングは、1-10 ng の DNA を用いて TaqMan ジェノタイピングまたはサンガーシークエンスを用いて実施した。予後と関連のある SNP を抽出するため、AML-05 研究コホートのうち好中球減少期間と予後との相関関係を認めた以前の研究で用いたコホート 2) をディスカバリーコホート（n=73）として、SNP の スクリーニングを行った。既報と同方向への予後 への影響で、有意に 3 年無再発生存率（RFS）と 相関の認めるSNPを抽出した。146名からこのディス カバリーコホートを除いたコホートをバリデーションコホートして用いた（n=73）。この研究は、千葉大学の生命倫理審査委員会の承認を得て行った（千葉亥研第 301 号）。サンガーシークエンス DCK 遺伝子の rs4643786 多型について、サンガー シークエンスにより解析を行った。PCR 反応は、Thermal Cycler Dice Standard（タカラバイオ株式会社、滋賀県）を使用し、最終反応液量 20 µL で
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