I0**I10*I9630* ANRmnitca-βybdezilamronANRmSSAOANRmnitca-βybdezilamronANRmSSAOANRmnitca-ββyybdezilamronANRmSSAOg R N A-1g R N A-7g R N A-1g R N A-70.20.160.120.080.041.20.80.60.40.27.54.51.5AU565AU565**CAMA1CAMA1図6T47DT47D図 6 OASIS プロモーター 3’側領域の脱メチル化による OASIS の発現回復Non-targeting、gRNA-1、gRNA-7 を 組 み 込 ん だ エ ピ ゲ ノ ム 編 集 用 コ ン ス ト ラ ク ト を 乳 が ん 細 胞 株（T47D、AU565、CAMA1）に導入した際の OASIS mRNA 発現レベルを示した real-time PCR 解析。3 つの細胞株全てにおいて、gRNA-7を組み込んだエピゲノム編集用コンストラクトの導入によって OASIS プロモーターの 3’側領域を脱メチル化すると、最も効果的に OASIS mRNA の発現レベルが上昇する。Mean ± S.E.、n=3、ANOVA Tukey post-hoc test *p < 0.05、**p < 0.01。gRNA-7 を組み込んだエピゲノム編集用コンストラクトを導入すると、T47D細胞およびAU565細胞における 3’側のメチル化レベルが特に低下した。CAMA1 細 胞 で は 通 常 状 態 で 3’側 の メ チ ル 化レベルが低いが、3’側のメチル化レベル低下がさらに低下していた。以上より、gRNA-1もしくは gRNA-7 を導入することで各細胞の OASIS プロモーター 5’側あるいは3’側を脱メチル化できることが確認された。 さらに特定の領域を脱メチル化した各種細胞でreal-time PCR を 行 い、OASIS mRNA の 発 現を 調 べ た。T47D 細 胞 お よ び AU565 細 胞 で は、gRNA-1 もしくは gRNA-7 のどちらを組み込んだエピゲノム編集用コンストラクトを導入した場合でも OASIS mRNA の発現上昇が認められたが、gRNA-7 を導入した細胞ではより大幅な発現回復が観察された（図 6）。CAMA1 細胞では図 4でも示した通り、通常状態における OASIS mRNA の発現レベルが T47D 細胞より 200 倍以上、AU565g R N A-1g R N A-7202（T47D細胞、AU565細胞、CAMA1細胞）をモデルとして使用した。これらの細胞は、T47D 細胞：プロモーター領域全体で高メチル化かつ OASIS低 発 現、CAMA1 細 胞：3’側 で 低 メ チ ル 化 か つOASIS 高発現、AU565 細胞：5’側で低メチル化か つ OASIS 低 発 現 と い う 異 な る 特 徴 を 示 す。各細胞に OASIS プロモーター領域内の 5’側を認識する gRNA（gRNA-1）、あるいは 3’側を認識する gRNA（gRNA-7）を組み込んだエピゲノム編 集 用 コ ン ス ト ラ ク ト（図 5A） を 導 入 し、bisulfite sequencing解析でOASISプロモーターのDNAメチル化レベルとメチル化領域を検討した。メチル化領域は、図3A で示した 3 つに分割した各領域で調べた。gRNA-1を組み込んだエピゲノム編集用コンストラクトを導入することで、T47D細胞および CAMA1 細胞における 5’側のメチル化レベルが大きく低下することが確認できた（図5B）。AU565 は通常状態で 5’側のメチル化レベルが低いため、大幅な脱メチル化はみられなかった。
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