結 果お け る OASIS プ ロ モ ー タ ー の DNA メ チ ル 化 と OASIS 発 現 と の 関 連 を 評 価 し た。mR NA量 の 内 在 性 指 標 と し てβ-actin （ 5’- T C C T C C C T G G A G A A G A G C T A - 3’、 5’-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3’） の 発 現レベルを検出した。統計解析 各データは平均値±標準誤差（S.E.）として示した。3 群以上の統計的比較解析は 1 元配置分散解析（ANOVA）を実施し、その後に Tukey 検定を行った。統計学的有意水準は p<0.05とした。エピゲノム編集用コンストラクトに挿入されたガイド RNA 配列によって腫瘍成長の抑制効果が異なる 研 究 代 表 者 は DNA 切 断 活 性 を も た な い 変 異 Cas9 と脱メチル化酵素 TET1 の酵素活性領域および OASIS プロモーターを特異的に認識するgRNA を all-in-one システムで同時に発現するエピゲノムコンストラクトを作成し（図 1A）、OASISプロモーターのDNAメチル化を特異的に脱メチル化することに成功している 12)。一方でOASISプロ モーター領域は約 800 bpにわたると考えられている（ 図 1B）。 そ こ で、 こ の OASIS プ ロ モ ー タ ー領域内のうち、OASISの発現に最も影響をおよぼすDNA 領域を調べた。OASIS プロモーター領域の各 DNA 配列を認識する gRNA を 7 種類（1 〜 7）設定し、これを挿入したエピゲノム編集用コンストラクト作成した（図 1C）。免疫不全マウスに異種間移植した膠芽腫細胞株U251MG細胞の周囲に各コンストラクトを in vivo transfection 試薬と 混合して直接投与した後、腫瘍を摘出した。するとgRNA-6 お よ び gRNA-7 を 発 現 す る コ ン ス ト196各がん細胞株におけるOASISプロモーター領域のメチル化レベル解析 各種がん細胞株（膠芽腫由来細胞株：U251MG 細胞、U87MG 細胞、乳がん由来細胞株： MCF7細 胞、SK-BR-3 細 胞、T47D 細 胞、BT474 細 胞、ZR-75-1 細胞、MDA-MB-468 細胞、CAMA1 細胞、 HCC1806 細胞、AU565 細胞、MFM223 細胞、前立腺がん由来細胞：PC3 細胞、結腸がん由来 細胞：LS174T細胞、骨肉腫由来細胞：U2OS細胞）か ら NucleoSpin Tissue XS（Takara）を 用 い て DNA を抽出し、OASIS プロモーター領域の DNAメチル化レベルをBisulfite sequencing解析で調べた。抽 出 し た DNA は Methylamp DNA Modification kit（Epigentek）を用いてBisulfite処理を行った。がん細胞株におけるエピゲノム編集技術を用いた脱メチル化実験 各種乳がん細胞（T47D 細胞、AU565 細胞、CAMA1細胞）にエピゲノム編集用コンストラクト（2 µg）をtransfectionによって導入し、72時間経過後に「各がん細胞株におけるOASISプロモーター領 域 の メ チ ル 化 レ ベ ル 解 析 」 と 同 様 の 手法でBisulfite sequencing解析を実施することで、OASISプロモーター内の各領域における DNA メチル化レベルを調べた。Real-time PCR法によるOASISの発現解析 「がん細胞株におけるエピゲノム編集技術を用 い た 脱 メ チ ル 化 実 験 」 で 使 用 し た 各 種 細 胞か ら ISOGEN（Nippon Gene） を 用 い て RNA を回 収 後 、 逆 転 写 反 応 に よ っ て 相 補 的 D NA を合成した。この相補的 DNA と作成した primer（5’-GAACATGGAGGACTTCTCCAATG-3’、 5’-CGGGCTCTGCTCCTGCTTCAC-3’）を 用 い て real-time PCR を 実 施 し、OASIS mRNAの 発 現 レ ベ ル を 調 べ る こ と で 各 種 が ん 細 胞 に
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