non-IBDUC結 果CD合 成 し た。 定 量 PCR は CronoSTAR 96 Real-Time PCR System（Waken B Tech）で実施した。ATHO1 遺伝子発現量は GAPDH に対して正規化し、以下のプライマー配列を用いた。 ATHO1, 5’- AACGCCTTGTCCGAGCTGCTA-3’ and 5’-TTTTGCAGGAGGCTGGAG-3’ GAPDH, 5’- GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’ and 5’- ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’日本人クローン病患者においても小腸パネート細胞数の減少を認める H＆E 染色標本の観察では、小腸陰窩（crypt）の 底部には明瞭な分泌顆粒を有するパネート細胞 が多数確認され、非クローン病群と比較して、 クローン病群では 1 陰窩あたりのパネート細胞 数が減少していた（図 3）。さらに、非クローン 病群を潰瘍性大腸炎群と非 IBD 群に分けて解析 したところ、両群間には有意差が認められず、 パネート細胞の減少はクローン病に特異的な変化 であることが示された（data not shown）。日本人のクローン病患者におけるパネート細胞異常の解析図 3 小腸陰窩におけるパネート細胞数の計数非炎症性腸疾患 (non-IBD)、潰瘍性大腸炎 (UC)、クローン病 (CD)、それぞれの Hematoxylin and eosin (H&E) 染色標本の代表的な解析像。黄色矢頭はパネート細胞。スケールバー：10 µm。96 ウェルプレートに播種した。オルガノイドはヒトorganoids）は、刺激前後で形態的に明瞭なオルガ100 µg/mL および Hoechst 33342（Tocris Bioscience） 100 µg/mL で 30 分間染色し、死細胞（赤色）および オ ル ガ ノ イ ド か ら の 全 RNA 抽 出 は、RNeasy 抽 出 RNA か ら PrimeScript IV 1st strand cDNA TNFα（PeproTech）100 ng/mL 存在下または非存在下で 48 時間刺激し、4 連複（quadruplicate）にて実施した。オルガノイド生存率（％ viable ノイド数を計測することで算出した。構造が凝縮 して不透明になったものや接着性を失ったオルガノイドは除外し、またこの結果は以下に述べる 蛍光顕微鏡解析によっても確認した 9)。簡潔には、 オルガノイドを propidium iodide（ナカライテスク） 生細胞（青色）の蛍光をキーエンス蛍光顕微鏡 BZ-X800（Keyence）で観察・定量している。定量 RT-PCR（qRT-PCR）Mini Kit（QIAGEN）を用いて行った。培養 10 日目に、培地を IntestiCultTM から IGF1 + FGF2（IF）分化培地へ切り替えた後に RNA を回収した 16)。Synthesis Mix（Takara Bio） を 用 い て cDNA を147
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