vacuolatedes日本人のクローン病患者におけるパネート細胞異常の解析disordered対象と方法≦ 7対象患者 東京科学大学病院の潰瘍性大腸炎・クローン病先端医療センター（IBD センター）および消化器内科を受診した患者のうち、2015 年から 2023年までの間に小腸内視鏡もしくは大腸内視鏡検査により回腸末端部から生検を施行された 212 症例（クローン病 126 症例、非クローン病 86 症例）を対象として、病理部に保存されていた病理サンプルを用いて解析を行った（承認番号：M2023- 129）。パネート細胞数と杯細胞数の計数 小腸組織切片は本学人体病理学分野において作製され、パネート細胞は Hematoxylin & Eosin（H&E）染色標本を用いて、また杯細胞は PAS/Alcian Blue染色標本を用いて解析した。各サンプルにつき、少なくとも 10 個の小腸陰窩（crypt）を観察し、パネート細胞および杯細胞の数を計測した。また、以下すべての顕微鏡データ解析は、2 名の研究者が群情報に対して盲検化（blind）された状態で、独立して実施した。免疫組織化学（Immunohistochemistry） 病理部に保管されていたパラフィンブロックから未染色スライドを作製し、Lysozyme 染色、TUNEL 染 色、Cleaved Caspase-3（CC3） 染 色 を施行した。Lysozyme 染色 キ シ レ ン で 脱 パ ラ フ ィ ン 処 理 を 行 っ た 後、HistoVT One（ナカライテスク）を用いて 95 ℃で 25 分間抗原賦活化を行った。蒸留水で洗浄後、 PBS 中 の 0.1% Tween-20（Sigma-Aldrich） お よ び 0.01% Triton X-100（Sigma-Aldrich）を用いて室温 で 20 分 間 透 過 化 処 理 し た。 そ の 後、Image-iT Signal Enhancer（ThermoFisher） で 室 温 30 分 間 インキュベーションを行い、続いて PBS 中 1% BSA で 30 分間ブロッキングを行った。次に、一次抗体（抗 lysozyme 抗体、Abcam）を 4 ℃で一晩反応 させ、洗浄後、二次抗体（Alexa Fluor 594 標識Donkey anti-Rabbit IgG、Thermo Fisher）を室温で 1 時間反応させた。核染色には DAPI ready solution with Antifide（Sigma-Aldrich）を使用した。定量解析では、各サンプルにつき少なくとも 10 個の小腸陰窩（crypt）を観察し、図 2に示す基準に従って、各パネート細胞を正常型・異常型に分類した。d iff uAbnormalNormaldiminished図 2 パネート細胞内顆粒の形態学的分類Cadwell らの先行研究（文献 4）によると、正常パネート細胞は明瞭な分泌顆粒が整然と配列した normal パターンをとり、ウイルス感染などの何らかのトリガーによって顆粒配列異常を示す disordered、分泌顆粒が減少した diminished、そして顆粒が崩壊してパネート細胞内に内容物が充満した diffuse などの異常パターンを示すことが提唱された。しかし、筆者らの研究では健常者・非クローン病患者であっても disordered や diminished を多く認めたため、disordered と diminished は normal のバリアントと考え「正常」とし、また空胞顆粒が多い状態を vacuolated として diffuse と共に「異常」とする、新たな基準を提唱する。145
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