ライブラリを用いたスクリーニングにはより簡便 に Sema6D を同定する実験系が必要と考えられた。定量 PCR で発現が確認された細胞株を用いて市販の抗 Sema6D 抗体を用いたフローサイトメトリーを施行したところ、発現を安定的に同定することができなかった。そこで、抗 Sema6D 抗体の作製を行った。Sema6D は種族間での相同性が高く、他種への免疫によって抗体を採取することが困難であったため、Sema6d ノックアウトマウスに対しリコンビナント Sema6D 蛋白を免疫することで抗体を作製した。リコンビナントセマフォリン蛋白をプレートにコートし、ELISA 法を用いて作製 抗体の結合能評価を行ったところ、作製抗体は濃度依存的にリコンビナント Sema6D 蛋白に対して結合した。一方で、リコンビナント Sema4A 蛋白に対しては結合が認められなかった（図 4A）。また、 データベース（The human protein atlas）で Sema6D図 3 がん微小環境において Sema6D は抗腫瘍免疫を抑制するSema6D はがん微小環境において主に腫瘍細胞と線維芽細胞に発現し、がん環境の CD8 陽性 T 細胞を抑制することで抗腫瘍免疫を阻害する。118と増殖が抑制された（図 2F）。さらに、ヒトのT 細胞に対する Sema6D の抑制機能についても同様に評価を行った。ヒト PBMC（末梢血単核細 胞 ） か ら T 細 胞 を 単 離 し、in vitro に お け る 抗 CD3 ＋ CD28 抗体による刺激にリコンビナント Sema6D 蛋白を加え、直接的な効果を確認した。その結果、Sema6D はヒト T 細胞に対しても増殖を抑制する活性を示した（図 2G）。 以上から、がん微小環境に発現する Sema6D は、CD8 陽性 T 細胞の腫瘍内への浸潤や活性化、増殖を抑制的に制御することが示された（図 3）。 続いて臨床検体を用いた新規 BM としての有用性の検討を行うとともに、Sema6D の発現機序を 解明するために細胞株を用いて Sema6D 発現を変動させる薬剤のスクリーニングを予定した。これまでの実験系では Sema6D の同定に定量 PCR を用いてきたが、BM としての有用性検証と化合物
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