CYP2D6 遺伝子多型は、はじめに、ゲノム DNAを使用して PCR 産物を精製した。得られた PCR産物のシークエンス解析は Fasmac（Kanagawa）に委託した。CYP2D6 遺伝子のコピー数は、Thunderbird probe qPCR Mix（Toyobo、Osaka）および TaqMan Copy Number Assay probe（Hs00010001_cn およびRNase P; Thermo Fisher Scientific、MA、USA）を使用してアレル特異的 PCR により解析した。使用したプライマー配列は既報を参考にして使用した 8）。CYP2D6 活性は、バリアントアレルごとの酵素活性指標に基づいて 9）、各遺伝子型を Activity score として分類し、表現型は Extensive metabolizer; EM, AS 1.6＜、Intermediate metabolizer; IM, AS 0.8–1.5および Poor metabolizer; PM, AS 0–0.7 として判定した。血中 CYP2D6 活性バイオマーカーの測定 前述の 94 検体由来の血漿検体 50 µL に、内標準物質としてコレステロール -2H を含むメタノールを 100 µL 加えて混合後、遠心分離上清を前頁で 構築した測定法により分析した。4-OHSND の定 量値が検量線範囲より高い検体は 50% エタノールで 5 倍希釈して再定量した。血中 TAM および TAM 代謝物の測定 TAM（Tokyo Chemical Industry、Tokyo）、4-OHTAM（Cayman Chemical、MI、USA）、NDT（Selleck Biotechnology、Kanagawa） お よ び END（Selleck Biotechnology）は、それぞれメタノールに溶解し、1 mg/mL の標準原液を調製した。各標準原液はアセトニトリルで段階的に希釈した後、市販のヒト血漿 (Cosmo Bio）で 20 倍希釈し、検量線作成用標準溶液および QC 用標準溶液（LLOQ、LQC、MQC、および HQC）を調製した。各サンプル濃 度 は表 1に 示 す。 検 量 線 サ ン プ ル 30 µL に、 内 標 準 物 質 と し て TAM-2H5（Toronto Research Chemicals, Vaughan, Canada）を含むメタノールを90OS（SCIEX）を用いた。分析カラムには CAPCELL PAK ADME（2.1 mm i.d. × 50 mm、2 µm、Osaka Soda）を用い、移動相 A には 0.1% ギ酸を含む水を、移動相B には 0.1% ギ酸を含むメタノールを用いてグラジエント条件で分析を行った。カラムオーブンは 40 ℃に設定し、流速は 0.3 mL/min とした。設定した MS/MS パラメーターは表 2 に示す。各検量線サンプルおよび QC サンプルを使用して、Food and Drug Administration（FDA）のBioanalytical Method Validation Guidance for Industry を参考に分析法バリデーション試験を行った。各化合物の血漿中におけるマトリクス効果は、市販のヒト血漿（Cosmo Bio、Tokyo）を使用して評価した。検体解析 ヒト血液検体および関連情報は、東北大学大学院医学系研究科倫理委員会の承認を得て使用し（承認番号：2021-1-928、2023-1-085）、本研究はヘルシンキ宣言および「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」を順守して実施した。CYP2D6 遺伝子多型解析 2022 年 4 月から 2024 年 10 月に同意の得られた研究協力者 94 名由来の血液検体から、QIAamp DNA Blood Kit（QIAGEN、Hilden、Germany）を使用して、添付マニュアルに従い、ゲノム DNAを抽出した。を鋳型として PrimeSTAR GXL DNA polymeraseを使用した PCR により全エキソン配列を含む領域を特異的に増幅し、FastGene Gel/PCR Extraction Kit（Nippon Genetics、Tokyo）を使用して PCR産物を精製した。次いで、得られた PCR 産物を鋳型として AmpliTaq Gold 360 Master Mix を使用した各エキソン領域をそれぞれ特異的に増幅した後、FastGene Gel/PCR Extraction Kit（Nippon Genetics）
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