結 果調製した192検体のライブラリは、それぞれ10 nMに希釈後、1つの溶液にプールし（終濃度 10 nM）、シーケンシング用試料とした。次世代シーケンシング解析 次世代シーケンシング解析には、NovaSeq 6000 system および NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit v1.5（Illumina）を用いた。シーケンシングにより得られた塩基配列（シーケンシングリード）は、UDIにより検体ごとの塩基配列として整理した。シーケンシングリードデータは、python（version 3.12）を用い、Trimmomatic（version 0.39）によるアダプター配列の除去およびFastQC（version 0.12）による品質評価を行い、miRge3.0によるUMIに基づいた重複リードの除去およびmicroRNAの塩基配列データベース（miRBase_v22, Homo sapiens）に対するアライメントを行った。また、miRNAの発現量比較にはR（version 4.4）を用い、edgeR（version 4.2）による正規化および群間比較を行った。統計解析 miRNAの発現変動解析では、2群間におけるBenjamini-Hochberg法によるfalse discovery rate（FDR）が0.1未満のmiRNAを有意と判断した。患者背景データの比較においては、連続変数にはMann-Whitney U test、カテゴリ変数にはFisher’s exact testを用いた。各データは特に記載がない限り、中央値（四分位範囲, IQR）または人数（割合, ％）で示した。患者背景および臨床的有効性 miRNA発現量解析の対象とした64名の難治性喘息患者の投与開始時における患者背景を表1に示した。女性患者の割合は49名（76.6％）であり、年齢の中央値（IQR）は55（48, 66）であった。GETEスコアに基づいて、投与後24週において14の5段階で評価するものであり、投与開始後24週においてExcellentおよびGoodであった患者を有効とした。また、臨床的寛解は投与開始後24週までに増悪がなく、24週時点において経口ステロイド薬の服用がなく、ACQスコア1.5未満かつACTスコア20以上、呼吸機能が正常化（予測1秒量80％以上）または安定化（実測1秒量5％以上の減少なし）した患者と定義した。血漿中miRNA抽出およびライブラリ調製 血漿中miRNA発現量解析には、投与後24週まで投与が継続され、投与0週、8週、24週において全ての評価項目データが得られた64名の血漿検体を用いた。これら64名の対象患者の0週、8週、24週の血漿検体（計192検体）より、miRNAを抽出し、次世代シーケンシング解析のためのライブラリ調製を実施した。 miRNAの抽出には、miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit（Qiagen）を用いた。凍結保存（−80ºC）された血漿を解凍後、遠心（15,000 g, 15 min, 4ºC）処理し、上清200 μLを抽出用検体とした。メーカー提供のプロトコルに従い抽出操作を行い、最終的にmiRNA抽出溶液18 μLを得た。 ライブラリ調製には、QIAseq miRNA Library Kit（Qiagen）およびQIAseq miRNA Index Kits with Unique Dual Index Kits（Qiagen）を用いた。miRNA抽出溶液5 μLより、3’ライゲーション反応、5’ライゲーション反応を行い、unique molecular index（UMI）を付加させたプライマーを用い逆転写反応を行い、miRNA 1分子に対して異なるUMIが付加されたcDNAを得た。cDNA溶液をクリーンアップ後、検体ごとに異なるunique dual index（UDI）を添加し、PCRによる増幅を行った。各検体より調製したライブラリのDNA濃度は、QuantiFluor ONE dsDNA System（Promega）を用い、蛍光法により定量した。また、ライブラリのサイズ（塩基数）は、マイクロチップ電気泳動装置MultiNAおよびMultiNA DNA-500キット（Shimadzu）により評価し、ライブラリの品質を確認した。
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