A/2＊B＊/miK50C/f43210量現発子伝遺量現発子伝遺量現発子伝遺1-1btcAgThdpaGhdpaGhdpaG2.01.51.00.50.0201510結 果対照群タクロリムス群対照群タクロリムス群対照群タクロリムス群倫理的遵守 本研究は自治医科大学動物実験委員会より承認を得て行った（承認番号：23008-01）。マウスおよび腎線維化の評価 腎採取時のマウスの体重（平均値±標準誤差）は2 群間で有意差がみられなかった（タクロリムス群：対照群 = 45.9 ± 0.8 g : 47.0 ± 0.5 g、p=0.27）。マッソン・トリクローム染色ではタクロリムス群にて腎組織の尿細管および間質の青色への染色がみられ、組織の萎縮と線維性変化がみられた（図 2）。qPCR 結果 腎障害および腎組織の線維化を確認するため、組織線維化のバイオマーカーとして Actin alpha 2（Acta2）および Transforming growth factor beta1 （Tg f b1）、腎障害バイオマーカーとして Kidney injury molecule-1（Kim-1）について qPCR を行った。Tgfb1 は両群間で有意差はみられなかった（p=0.26）が、線維化の指標とした Acta2、と腎障害の指標とした Kim-1 はタクロリムス群にて対照群に対し有意に高値であった（タクロリムス群 / 対照群、Acta2； 1.48、 p=0.02、 Kim-1； 6.48、p=0.01 ）（図 3）。図 3 Quantitative PCR の結果（A）は Actin alpha 2 （Acta2）（B）は Kidney injury molecule-1（Kim-1）、（C）は Transforming growth factor beta1（Tgf b1） を示す。統計解析は unpaired t- 検定で行い、＊p<0.05（平均値±標準偏差、n=10/群）。128した。最後に THUNDERBIRD® Next SYBR® qPCR Mix（TOYOBO）を用いて次のサイクル条件にてPCR を行った。サイクル条件：初期変性、95 ℃60 秒間を 1 サイクル、PCR：変性目的に 95 ℃ 5秒間および伸長目的に 60 ℃ 30 秒間を 1 サイクルとして計 40 サイクル。内因性標準遺伝子としてはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（Gapdh）を使用した。比較 CT（ΔΔ CT）値と対照群を基準とした相対値は、得られた CT 値よりExcel を用いて算出した。今回の qPCR に使用したプライマー配列は以下のものを用いた。 Acta2：Forward；AGTGTGATATTGACATCAGGAAGGA Reverse；ACAGAGTACTTGCGTTCTGGAGKim-1：Forward；TCCACACATGTACCAACATCAA Reverse；GTCACAGTGCCATTCCAGTCTgfb1：Forward；ACTGGAGTTGTACGGCAGTG Reverse；GGCTGATCCCGTTGATTTCCGapdh：Forward；TGTGTCCGTCGTGGATCTGA Reverse ； TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG統計解析 CE-FTMS で測定された代謝物の解析は Welch の t- 検定で実施した。qPCR の測定結果の解析はGraph Pade Prism version 7.00 を用いて Unpaired t- 検定で統計解析を行った。統計的な有意差はp<0.05 とした。
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