図2 研究内容・研究方法の概要、するアミノ酸配列に変異を加えることでキナーゼが作用しないVP30変異体を構築した。プロテオミクス解析 前述の各VP30変異体を培養細胞に過剰発現させ、共免疫沈降法で被リン酸化部位を持つVP30変異体と特異的に相互作用するキナーゼを回収し、質量分析法で同定を試みた。リン酸化検出アッセイ In vitroと細胞内、それぞれで各VP30変異体のリン酸化を検出した。前者では、精製タンパク質と市販の精製キナーゼをキナーゼリアクションバッファー内で反応させた。後者では、培養細胞に各VP30変異体と該当のキナーゼを共発現させることでリン酸化の状態が変化するか観察した。リン酸化の検出には、in houseのリン酸化検出抗体を用いた。レポーターアッセイ VP30を特異的にリン酸化するキナーゼが転写・複製機能に及ぼす影響を、レプリコンを用いたレポーターアッセイ法や定量PCR法を行い評価した（EBOV特異的ミニゲノムとNP、VP35、各VP30変異体、Lタンパク質を共発現させた細胞を用いた）5）。キナーゼ阻害アッセイ キナーゼ阻害剤や遺伝子サイレンシング法を前述のレポーターアッセイに適用し、各VP30変異体の転写・複製制御機能がどのように変化するか評価した。タンパク質間相互作用の解析 宿主キナーゼと各VP30変異体間の相互作用を蛍光抗体法・共免疫沈降法で評価した。BSL-4における感染実験 感染性ウイルスを用いた実験を共同研究先で78
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